秀吉の病死後、真田氏は家康に従って行動をとっていました。

１６００（慶長５）３月、家康が伏見から大坂に移ると、それに伴い真田氏も伏見から大坂に移りました。
多くの大名に対して家康の影響力が強くなり、これまでの合議制による豊臣政治が崩壊しました。
五大老は各所領に帰国し、徳川氏との対立を深めていきました。
特に上杉景勝は家康に反抗する姿勢を示し、領地である会津に戻り籠城に近い状況になりました。

６月１６日、五大老の中で家康の上洛命令に従わなかった上杉景勝を討伐するために、家康は大坂から関東へ約６万の大軍を率いて向かいました。（会津征討）
家康は自分が大坂から離れると反徳川勢力である石田三成が挙兵することを確信していたようで、徳川軍は反徳川の勢力が兵を挙げるかどうか様子をうかがいながら東に進み、秀吉恩顧の大名であった福島正則・黒田長政・細川忠興・堀尾忠氏・浅野幸長・池田輝政らも家康に同調し、江戸に集まり出しました。

この頃、三成は秀吉恩顧の大名に対して徳川討伐の挙兵に協力するよう要請をしています。会津の上杉氏と西国の大名で挟み撃ちにする意図がありました。

７月に入ると、石田三成は佐和山城から大坂城へ移り、かつての五奉行衆に名を連ねていた増田長盛・長束正家・前田玄以らと共に秀頼を擁立して兵をあげました。しかし、増田長盛は徳川方のスパイだったので、西軍の情報は筒抜けだったようです。

７月１９日、西軍の宇喜多秀家・島津義弘・小早川秀秋らは家康の留守居役である鳥居彦左衛門が守る伏見城を攻撃し、関ヶ原の決戦に向けて大きな戦闘が始まりました。

信幸は江戸まで兵を率いて将軍秀忠のもとへ参陣し、１６００（慶長５）年７月１９日、他の徳川家臣とともに徳川本隊として江戸を出発しました。

７月２０日、昌幸・信繁は下野の犬伏宿に着陣し、秀忠隊も宇都宮に着陣しました。

７月２１日、犬伏宿にて待機していた昌幸へ石田三成から７月１７日付の密書が届きました。その手紙は豊臣氏の奉行である長束正家（なつか　まさいえ）・増田長盛（ました　ながもり）・前田玄以らの連名があり、豊臣家をないがしろにする家康を討伐するために西軍へ加わって欲しいというもので、密書を届けた使者からは昌幸の娘婿である宇田頼次と信繁（幸村）の義父である大谷吉継が西軍に入ったということを聴きました。
昌幸は信繁（幸村）に、信繁（幸村）にとって義父である大谷吉継が西軍に入ったことを伝えたと思われます。
これを受けて昌幸は、秀忠本陣付近にいた信幸を呼び寄せて、犬伏のとある民家の離れに呼び、真田父子３人で今後の行動について話し合いました。この時、話し合いが長くなっていることを心配した家臣が様子を見に行ったところ、それに気が付いた昌幸は「誰も来るなと命じたはずだ。」と怒鳴り下駄を投げつけ、その下駄が顔に当たって家臣の歯が折れてしまったと言う逸話が伝わっています。
真田父子３人で話し合った結果、昌幸は過去の経緯から家康に対して信頼感を持つことができず豊臣方になることを選択し、長男信幸は正室が本多忠勝の娘で徳川家康の養女であることや、徳川氏の家臣として沼田領の領主になったという経緯もあったため、徳川方につきました。次男信繁（幸村）は豊臣氏の家臣であり、正室である竹林院の父である大谷吉継が石田三成からの説得で豊臣方になったことともあり、父昌幸に従いました。
その結果、昌幸と信繁（幸村）は豊臣方へ、信幸は徳川方へと別れて、それぞれ西軍と東軍に入り、親子で敵対する陣営に別れてでも、武士としてそれぞれの立場を保ちつつ真田氏の家系と領地は守らねばならないと判断したのです。

真田氏が徳川方と豊臣方の東西に別れたことを詠った川柳があります。
「東西にみごろを分ける真田縞　銭づかい上手にしたは昌幸　たね銭が関東方に残るなり」

１６００（慶長５）７月２１日、大坂から江戸に着いた家康は、上杉氏を牽制するために江戸を出発し北上しました。

７月２３日、西軍に加わることを決めた昌幸と信繁は上田へ戻るため、下野の犬伏を出発しました。
昌幸と信繁は犬伏から上田へ帰る途中で沼田城に立ち寄ろうとしましたが、信幸の妻である小松殿は２人を城に入れるとそのまま占領されてしまうのではと危惧し、昌幸らは入城を拒否されました。
信之は滞在する宇都宮から小松殿に対して「父弟が沼田に寄った時は城内に入れないように」という指示を２人が到着する前に出していた可能性があります。
沼田城への入城を拒否された昌幸・信繁（幸村）は、武力で沼田城を攻略することなく、上田へ帰りました。この時、信繁（幸村）が腹いせに沼田城下へ火を放とうとしたところ、昌幸に止められたという話も伝わっています。

西軍にとって、沼田は大坂から上田、さらに会津までの連絡中継点として重要な場所でした。

家康は上杉討伐の先発隊である秀忠と合流し７月２４日に下野の小山に着陣しました。
信幸は着陣した家康に拝謁し、東軍に加わったことを報告した上で、嫡子である信政を人質として江戸へ送ることを確約し、忠誠を誓いました。 この時、家康は東軍に入った信幸を大いに褒め称えたと言われています。
会津や越後などの監視をする為に沼田へ戻った信幸は、４歳だった信政を人質として江戸に送りました。
家康は７月２７日付けの書状で、昌幸の領地である小県郡を信幸に与えることを約束しました。

７月２５日に徳川氏率いる東軍は、石田三成を中心とする西軍に対して合戦を挑むことを小山にて話し合い、福島政則・池田輝政らが先発隊として西に兵を進みはじめました。
家康は江戸に戻って諸大名に向かって自分へ味方するように連絡を取りつつ、周囲の状況を伺っていました。このことは、家康が東軍である福島政則らかつて秀吉恩顧であった大名を完全に信頼しきっていた訳ではなく、大坂を出発した時から上杉や伊達の行動を注意深く見守りつつ、味方の中にも分裂の要素が多分にあった事を物語っています。
東軍が、上杉氏から背後を突かれて大損害が出る可能性は、伊達氏が東軍に入ったことで、ほぼ解消され、東北では伊達氏と上杉氏が対立する構図が固まりました。

西軍として行動するために上田へ戻った昌幸は、三成に対して挙兵について事前に相談がなかったことを三成に手紙で怒り、さらに８月に入った時点でも三成西軍へ正式に加わるという返事を昌幸は出しませんでした。三成を焦らす事で西軍での真田氏の重要性を強調するためだったようで、信幸が東軍になったことも８月に入るまで西軍には伝えていませんでした。その間に三成は昌幸を西軍に引き入れるため、何度も昌幸宛に書状を書いています。
７月３０日付の書状で三成は、今回の決起の事を事前に昌幸へ相談しなかったことを詫び、８月１０日付では信州のみならず甲斐までも昌幸に任せることを西軍幹部で決めた事を書くなど、三成の昌幸に対する気遣いは日に日に高まっていきました。

８月１０日、石田三成が大垣城に入城し、東軍との衝突に備えました。

８月２１日、信之は会津と上田の中間に位置する沼田で国境の警備を指揮するために、沼田に戻るため出発しました。

福島らの東軍先発隊の活躍を知った家康は、上杉氏への牽制で宇都宮に留めておいた秀忠軍に西へ向かうように命令しました。
秀忠は家康の後継者であり、事実上の徳川方本隊であったと思われます。
秀忠は東西決戦が行われるであろう尾張方面に向かう途中で、信濃の諸大名で唯一西軍に加勢した真田昌幸・信繁（幸村）を征伐をすることになりました。この時、沼田にいた信幸にも昌幸・信繁（幸村）討伐に参加するように命令が出ました。
秀忠に従い討伐に参加した主な武将は、本多正信・榊原康政・大久保忠隣・大久保忠常・本多忠政・酒井家次・奥平家昌・菅沼忠政・牧野康成・戸田一西・小笠原忠成・石川康長・諏訪頼水・西尾吉次らに、信濃の外様大名である森忠政・仙石秀久・真田信幸らも加わりました。
家康から秀忠の補佐役を命じられていた本多正信は真田討伐について反対しましたが、これを秀忠は聞き入れなかったと言われています。

８月２３日、福島政則・池田輝政ら東軍先発隊が岐阜城を落としました。
そして、先発隊は大垣北方の赤坂まで兵を進めて、家康が来るのを待ちました。

８月２４日、秀忠は沼田で警備していた信之に対し上田城攻めを行うので参陣せよと命令し、秀忠隊約３８０００人の兵は真田昌幸・信繁（幸村）がいる上田城を目指して宇都宮を出発し、中山道を西へ進み、８月２８日には松井田に到達しました。

同じ日、東軍先発隊は岐阜城を陥落させ、さらに合渡川の戦い、犬山の戦いにも東軍は勝利しました。
福島政則ら東軍先発隊の快進撃や西軍への内部工作の進展、そして上杉と伊達が動かない事など、自分に有利な状況が整ったと感じた家康は９月１日になって、ついに江戸城から約３００００人の兵を率いて東海道を西へ進み始めました。

９月１日、秀忠隊は碓氷峠を越え軽井沢に着き、９月２日には道案内役の信幸と共に小諸城に着陣しました。
真田信幸と本多忠政を上田へ派遣して降伏を勧告しました。
忠政は小松殿の兄であり、信幸にとって義兄でした。
信濃国分寺で真田方と徳川方による会議が行われました。

９月３日、上田城で籠城している昌幸が信幸を介して秀忠に降伏してきましたが、翌日９月４日に昌幸の降伏は嘘であることが判明し、時間稼ぎであることを知った秀忠は森忠政に真田氏への攻撃を命じました。
これにより、秀忠が率いる東軍本隊と真田昌幸・信繁（幸村）父子による第二次上田合戦が始まりました。 （秀忠２２才）
攻める徳川秀忠隊の３万８０００人に対し、これを迎え撃つ真田方は多く見ても５０００人だったと言われています。
第二次上田合戦が史料上で判明している信繁（幸村）の最初の戦いです。

信幸は秀忠から信繁（幸村）が守る戸石城への攻撃を命じられ、あわや兄弟対決になろうかという場面でしたが、９月５日に兄弟対決を嫌った信繁が（幸村）が戸石城から上田城へ退却し、それは回避されました。
信幸はまず、信繁（幸村）が退却した戸石城に隣接した伊勢崎城に入り、続いて戸石城に入りました。
これに伴い秀忠は味方である信幸が入った戸石城を背にして、上田城と向かい合う位置にある染屋に陣を構えました。

９月６日、秀忠は稲刈り部隊に牧野康成を任命して、稲の刈り取り作業を始め、上田城にに籠もる真田方を挑発しました。
上田城から数十人の真田方の妨害部隊が出てきました。
真田方の兵を追って、刈田をしていた康成の嫡男である忠成の部隊が、挑発に乗って上田城の城壁近くまで押し寄せました。
この瞬間を狙っていた真田方は城内から一斉射撃を始めました。

上田城内から真田の部隊が出てきたのを見て、人数で勝る秀忠隊はこの挑発に乗ってしまい、上官が攻撃を制止してももはや止めることはできませんでした。
秀忠軍は上田城の周りへ押しかけましたが、城内からの一斉射撃を受け大きな損害を出しました。

昌幸と信繁（幸村）は徳川方を挑発する様に４０～５０騎を率いて上田城外へ偵察に出ました。
これを知った秀忠は依田肥前守の鉄砲隊に攻撃させ、昌幸と信繁（幸村）は交戦せずに城内へ引き揚げました。

真田氏の策略によって徳川方は混乱に陥って敗退し、戸石城までも真田軍に奪還されるなど、上田城周辺で激しい攻防戦が繰り広げられました。
人数で圧倒的有利な状況であるはずの徳川方が混乱し、敗走する部隊が出る中で徳川方の槍の達人７人が真田氏との戦闘で目立つ戦果を収めたようで、この武者達には「上田七本槍」と言う異名がつきました。

徳川方は大混乱に陥り、多くの死傷者を出して神川を越えて撤退し始めました。

本多正信は軍令違反をした部隊を厳しく処分し、大久保忠隣の旗奉行である杉浦文勝、牧野康成の旗奉行である贄掃部（にえ　かもん）に切腹を命じました。
文勝は命令に従い自害しましたが、掃部は康成から逃亡を黙認されました。これにより康成は軍列から外され、後にこの責任を問われて領地を没収されました。
９月７日になると秀忠は上田攻撃を中止し、小県郡から小諸城に退却しました。

真田氏に対しては、最小限の抑えの部隊を残して西を目指すべきという本多正信などの意見と、真田氏に恥をかかされたため上田城を陥落させるまで戦うべきだという意見で、秀忠隊は２つに割れました。
その後も再度の大規模な攻撃を検討しましたが断念し、９月１１日（８日説も有）、石田三成側との本戦に間に合わなくなることを危惧した秀忠は真田氏討伐をあきらめ、西に向けて小諸城を出発しました。
秀忠軍は真田の勢力が支配している和田峠を避け、大門峠を越えて諏訪経由で木曽へ向かいましたが、仙石秀久・石川康長・日根野高吉・森忠政・真田信幸らは上田城への押さえとして小諸城に残りました。

徳川方は家康による第一次上田合戦に続いて、その息子秀忠による第二次上田合戦に際しても、上田城周辺に押し寄せて一斉射撃で叩かれるという同じ失敗を犯したのです。

９月１３日、秀忠隊は諏訪に到着しました。

９月１５日、ついに石田三成を中心とする西軍と徳川家康を中心とする東軍が衝突する「関ヶ原合戦」が起こりました。

次男信繁（幸村）の妻利世の父大谷吉継は関ヶ原にて戦死しました。

９月１６日、秀忠隊は木曽福島の山村良勝の館に到着しました。

９月１７日、佐和山城が陥落し、裏切りが続出した三成が率いる西軍は、家康が率いる東軍に敗れました。
昌幸五女（信繁（幸村）にとって妹）の夫である宇田頼次は父頼忠と共に西軍として石田三成の居城である佐和山城にて奮戦しましたが、戦死しました。

この時点で、秀忠隊は関ヶ原から遠く離れた木曽にいました。真田討伐に手こずり失敗した秀忠は結果として関ヶ原合戦に間に合いませんでした。

９月１９日、秀忠隊は美濃国赤坂宿（岐阜県大垣市）に到着しました。
結局、秀忠が大津城にいる家康隊に合流したのは９月２０日でした。秀忠は何日か家康に面会してもらえなかったと伝えられています。

昌幸と信繁（幸村）は西軍として上田城に籠城し、大軍である東軍秀忠隊の攻撃をかわしましたが、関ヶ原の戦いで西軍は敗退し、戦後処理は徳川氏主導のもとに行われました。
西軍の諸大名から没収された領地は、徳川氏譜代大名や東軍に入った外様大名（豊臣恩顧大名）に分け与えられました。
豊臣秀頼は摂津・河内・和泉の３カ国６６万石の一大名になりました。

家康は西軍として上田城に籠城し、将軍秀忠が率い東軍と戦闘を繰り広げた昌幸・信繁（幸村）に切腹を言い渡しました。これに対し、信之は徳川氏から自分へ与えられる恩賞を辞退し、正室小松殿とその父本多忠勝、さらに井伊直政と榊原康政を通じて助命嘆願をしました。これに秀忠が最も抵抗をしましたが 、本多正信からの勧めもあり家康は助命嘆願を受け入れて、秀忠も康政から説得されて、昌幸・信繁（幸村）の切腹は回避されました。
家康は１６００（慶長５）年１２月上旬、昌幸と信繁に対して下された死罪を免除し、高野山での幽閉を命じました。

１６００（慶長５）年１２月１３日、昌幸は近い立場にあった１６人の家来、信繁（幸村）とその妻である利世や子供、家来らと共に上田を出発しました。昌幸の正室である山手殿は九度山へは行かず、上田に残りました。
随行した家臣１６人は、池田長門守・原出羽守・高梨内記・小山田治左衛門・田口久左衛門・窪田作之丞・関口角左衛門・関口忠右衛門・河野清右衛門・青木半左衛門・飯島市之丞・石井舎人・前島作左衛門・三井仁左衛門・大瀬儀八・青柳清庵と言われています。（昌幸５４才、次男信繁（幸村）は３４才）

昌幸の妻である山之手殿は、その後出家して寒松院を名乗り、上田の北に位置する大輪寺で生活し始めました。

幽閉先の高野山についた昌幸たちは、真田氏をはじめとした上田小県の人々が菩提所としていた高野山蓮華定院をまずは訪れました。その後、滞在場所を数カ所転々と変えた後、蓮華定院の計らいで九度山に屋敷を構えて落ち着きました。これは女子は高野山に入れないため、適地を探していたのだと言われています。

一方、関ヶ原の戦いで東軍として徳川方についた信幸に対し、幕府は本領である吾妻郡・沼田領に加え、家康から約束されていた上田領６万５０００石を与えました。
９万５０００石の大名になった信幸は徳川氏に忠誠を誓うため、名前で昌幸から受け継いだ幸の字（諱）を変えて、信幸を「信之」に改めたのです。

２度にわたって徳川氏の攻撃をかわした上田城は昌幸が去った後、本丸や二の丸などの中枢部が徳川氏によって破壊され、信之が入城するまでの間は幕府の命令により佐久や諏訪の領主である諏訪氏・依田氏・大井氏・伴野氏などが城番を務めました。

１６０１（慶長６）年１１月、嫁である小松殿から昌幸の好物である鮭の子が九度山に届き、昌幸は小松殿に礼状を送りました。

１６０１（慶長６）年になって真田信之に上田城は引き渡されました。上田城の中枢部は利用できる状態ではなかったため、信之は現在の上田高校の地に居館を構えて藩政にあたりました。城主が城ではなく、城下の屋敷で政治を執ることを陣屋支配体制と言います。

１６０１（慶長６）年、この頃、信繁（幸村）の嫡子である大助（幸昌　ゆきまさ）が九度山で生ました。

１６０３（慶長８）年２月、家康が征夷大将軍となり江戸に幕府を開きま、翌年の１６０４（慶長９）７月１７日に徳川秀忠の嫡子である竹千代（のちの徳川３代将軍家光）が誕生し、そのまた翌年の１６０５（慶長１０）４月１６日に家康は将軍を秀忠が将軍に譲り、全国に徳川幕府の将軍は世襲制であり、豊臣氏への政権委譲はあり得ないことをアピールするなど、徳川氏の政権基盤の安定化が着々と進んでいきました。
同年７月、家康は孫の千姫を豊臣秀頼（６５万７０００石）と結婚させました。

その頃、家康から赦免されて自由になる日が近いと信じていた昌幸でしたが、徳川氏と豊臣氏の対立が続く中ではそれが実現しませんでした。

上田城に入った信之は、北国街道の整備とも関連して、宿場町でもあった上田城下町の区画整理を１６０５（慶長１０）年から始めました。
１６０５（慶長１１）年には上田城下町の区画整理を完了し、現在に続く原町・海野町の町並みが確定しました。
信之は沼田城の整備にも力を注ぎ、１６０７（慶長１２）、沼田城に５層の天守が建造されました。

昌幸や信繁（幸村）らの生活資金は信之のもとから出ていましたが、大名生活に慣れていた昌幸らにとって満足できる生活ではなく、借金が増え続けることになりました。
上田にいる信之からの定額の入金や地元の和歌山藩主である浅野幸長からの贈与だけでは足りず、臨時に必要になったお金の催促や、馬を送って欲しいと嘆願する手紙を数度にわたって昌幸は国元の親戚筋に書いています。

昌幸は関ヶ原合戦以前に、刀の柄巻が切れやすいことから真田紐を自ら編み出して、貞宗の太刀の柄巻にしたと伝えられています。
九度山に幽閉された昌幸らは、その真田紐を量産し、京や大坂で売りさばくことで生計を立てていました。昌幸にとって真田紐を売ることは、単に金銭を稼ぐというだけではなく、政治情勢を収集するための情報網を広げていくという目的もあり、九度山にいながらも政治的復活を目指した昌幸のしたたかな計算もあったのです。

浅野幸長は昌幸・信繁（幸村）が九度山へ来る１ヵ月ほど前に、関ヶ原合戦での戦功により甲斐の国から移ってきました。
幸長の父長政と昌幸は同世代で、共に秀吉の下に仕えていた事もあり、仲が良い付き合いがあった可能性があります。幸長は高野山で幽閉生活を送っている昌幸・信繁（幸村）に対しを複雑な感情を抱いていたいたことでしょう。
昌幸・信繁（幸村）が国元と書状を取り交わしたり、金の無心をする場合は、徳川氏の機嫌を損ねない範囲で融通を利かせていたと言われています。

昌幸が亡くなる直前についての逸話があります。病の悪化で死期が近づいていたことを悟った昌幸は、信繁（幸村）に「かねてより秘策を考えていたが、これを実行に移さず無駄死にするのは、まことに残念なことだ。」と語りました。これに対し信繁（幸村）はその計画を今後のために聴いておきたいと言いました。しかし、昌幸は「とてもお前では無理だ。」と言って計画を打ち明けることはなかった、または計画を打ち明けた後、「計画が優れているか否かではなく、それを真田昌幸が指揮するということが重要であり、将兵が信じて付いて来てくれるのだ。お前は優れた武将だが、無名であるがゆえ不安に陥る将兵も出てくるので、失敗するだろう。」と言ったとも伝わっています。

家康からの赦免を心待ちにして苦しい幽閉生活を過ごしていた昌幸は１６１１（慶長１６）年６月４日、かねてより患っていた病気が悪化、九度山にて逝去しました。
（真田昌幸 享年６５才）